产品原理

        “叠层衍射技术”：Livecyte采用“叠层衍射定量相位成像技术”（Ptychographic Quantitative Phase Imaging，Ptychographic QPI）：即采用计算成像方法，利用虚拟透镜（The Phasefocus Virtual Lens™）捕获衍射光波形成的相对相位偏移信息。同一个样本可以得到一系列衍射图像，叠加在一起，通过计算机重组生成高对比度的细胞图像。

         “叠层衍射技术”原理示意图：

        “叠层衍射技术”在透射光和反射光应用中都有极佳的表现。当提供合适的照明光源和检测器时，它可以利用电磁光谱中的任意波长的光线进行成像，包括电子和其他粒子波，甚至是声波。Livecyte就采用这种技术来捕获相对的相位偏移信息，在无荧光标记和无高功率照明光源的情况下，生成活细胞的高对比度图像和视频。适用于最敏感的活细胞（如干细胞、异质性的原代肿瘤细胞、神经细胞等）的长期成像（长达数周）。与传统的相差成像不同，Livecyte得到的非标记QPI图像与荧光图像类似，有极佳的对比度，如明亮的细胞影像和深色的背景（下图）。与基于群体的成像技术不同，Livecyte可以自动分辨、跟踪时序成像中的每颗单细胞，得到每颗单细胞随时间在形态、行为、干物质（dry mass）等指标上的变化，对单细胞进行识别和表征，从而得到每颗单细胞的完整的表型数据。

          Livecyte叠层衍射成像可实现媲美荧光的无标记高对比成像：

产品总述

       英国Phasefocus公司的Livecyte“实时细胞功能及单细胞行为分析系统”采用“叠层衍射实时定量成像技术”（Ptychographic QPI），可以在无标记、无高光毒性激光照射的情况下，产生高对比度、无伪影、可定量、高保真度的细胞图像，并对单个细胞进行自动识别、跟踪和定量，同时得到细胞群和单个细胞的长时间实时动态数据。

       Livecyte侧重于细胞的非标记成像和单细胞特性的记录，如在非标记状态下研究细胞在增殖、分裂、凋亡、分化、迁移等现象过程中的形态学变化和运动行为的变化，得到形态学指标（如单个细胞的面积、球形度、干物质量等）和运动学指标（如单个细胞迁徙速度、方向、位移、轨迹等）。可进行无标记识别分析细胞群、细胞谱系等研究。除了非标记叠层衍射实时定量成像，还可做明场和多通道（1-7通道）荧光成像。自带培养腔，可以做长时间活细胞实时成像。

        厂家Phasefocus在2013年因“叠层衍射实时定量成像技术”被授予“Microscopy Today Innovation Award”，并且Livecyte仪器在2017年又再获此殊荣。

产品特点

• 无标记衍射成像：

1.   比起明场、相差成像，Livecyte叠层衍射成像可实现媲美荧光的无标记高对比成像；

2.   无荧光标记下，对细胞伤害更小，适用于干细胞、神经细胞及原代细胞等较脆弱的细胞；

3.   如有需要，也可搭配最多七种荧光成像。

•  独特数据库与大数据筛选分析：

1.   独特数据展示与呈现，实验结果一目了然；

2.   可以实现多参数、多数据间的大数据筛选与比较，找出单一参数无法发现的细胞行为；

3.   多种类数据输出（原始数值、图像、影片、单细胞分割档案），可用第三方软件做灵活分析。

• 自动化单细胞分析+干物质量分析：

1.   可实现自动化分析，根据形态学和行为学特征对每颗细胞创建独特的“表型指纹”，省去繁复耗时的人工圈选步骤；

2.   可实现精确的单细胞分割、单细胞定量，得到每颗细胞的多种参数进行分析，其他产品少有可做到；

3.   多种参数及定量化信息：如：细胞汇合度、个数、单个细胞面积、厚度、干物质量（Dry Mass）、球形度、长宽比、周长、移动速度、瞬时移动速度、移动方向、迁移蜿蜒指数（Meandering Index）、限制比率（Confinement Ratio）、位移、分裂指数、倍增时间，等。

4.   可做独特的干物质量（Dry Mass）分析、无标记细胞谱系示踪分析、无标记细胞共培养分析，其他产品少有可做到。

细胞无标记时生长更好：

细胞谱系分析视频：

广泛的应用领域

Livecyte适用于细胞增殖、细胞毒性、细胞分裂、细胞吞噬、血管新生、划痕迁移、趋化运动、细胞运动、T细胞杀伤、细胞谱系研究、细胞共培养、单细胞研究等多个研究领域，尤其是无标记敏感细胞（原代细胞、干细胞、神经细胞）分析。

Livecyte应用展示。

无标记情况下，一次实验就可以获得多项细胞表型和功能数据，如：

1、 细胞增殖：获得细胞个数、细胞面积、细胞干物质的变化曲线、倍增时间等数据；

2、 细胞形态：获得每颗细胞及群体细胞的球形度、周长、长宽比、面积、厚度等数据；

3、 细胞有丝分裂：获得发生有丝分裂细胞的比例，有丝分裂的时间，分裂的细胞总数等数据；

4、 细胞生长：获得每颗细胞干物质，这个干物质是除去水之外的所有细胞成分（如蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA等生物分子）的总质量；

5、 细胞运动：获得每颗细胞运动的轨迹、速度、方向、角度、位移、路径等数据；

6、 T细胞杀伤：获得效应细胞与靶细胞的接触时间，靶细胞上有几颗效应细胞、效应细胞与靶细胞的命运等数据；

7、 细胞谱系：可以追溯每颗细胞的来源，输出谱系图，对研究细胞的异质性有很好的指导。

可以通过30多种参数进行流式分群分析，洞察更多的细胞功能。

1、无标记共培养研究

下图说明：用 Livecyte 无标记区分共培养的细胞亚群（原代前列腺癌混合细胞群 vs. TA细胞亚 群 vs. CB 细胞亚群）。对比了三个群的不同参数：细胞速度、迁移蜿蜒指数（Meandering index）、细胞面积、细胞长宽比、细胞干物质量（Dry mass）、细胞球形度（Sphericity）。

无标记神经细胞共培养

下图说明：Livecyte可分析细胞平均亮度与亮度分布，无标记下区分星状细胞、神经细胞及微胶细胞，分群后做单细胞分析。

2、细胞谱系研究

可无标记跟踪细胞的增殖、分裂、传代、分化、死亡，得到细胞的传代谱系图，尤其适合敏感细胞的谱系研究（如原代细胞、神经细胞、干细胞）和干细胞的发育分化研究。

下图说明：对同一个癌细胞群里的不同细胞进行谱系研究，自动进行单个细胞识别（左图）。右上图：干物质量（Dry Mass）显示细胞的生长和分裂，绿色标记细胞（Cell 1）和橘色标记细胞（Cell 2）都在同样的干物质量下分裂，但每代中绿色标记细胞（Cell 2）生长更快、分裂周期更短。右下图：细胞的谱系树，表示从初始单个细胞生长分裂成一群细胞。

下图说明：捕捉“罕见事件”：细胞9在第1次分裂后迅速融合（Fusion），表现为干物质量加倍；融合后的细胞继续增殖，然后进行第2次和第3次分裂；细胞干物质量一直比普通细胞大。

细胞谱系分析视频：

3、划痕迁移研究

对单细胞的自动识别、跟踪和定量分析可以提供深入的“划痕迁移”的指标，如细胞运动速度、运动方向和有丝分裂指数，可区分细胞运动和细胞增殖对“划痕愈合”的影响，克服基于“汇合度”研究“划痕愈合”的传统研究方法的局限性。

下图说明：Livecyte可自动识别和跟踪单个细胞，直接检测细胞的运动；可区分细胞运动和细胞增殖对“划痕愈合”的影响。

划痕迁移分析视频：

4、脂肪细胞分析

下图说明：可以看到细胞内的一颗一颗高亮度的脂肪颗粒，脂肪颗粒可被分割并定量，计算脂肪颗粒数目和干物质量。

5、细胞毒性分析

下图说明：研究细胞的凋亡和毒性

细胞毒性视频：

6、血管生成分析

下图说明：可研究血管细胞形成的血管网络，研究其中的单细胞行为变化。

血管生成视频：

7、肿瘤球分析

可分析药物作用下，肿瘤球的周长、面积的定量变化。

肿瘤球成像视频：

8、T细胞杀伤研究

T细胞杀伤实验能在体外研究工程T细胞杀伤靶肿瘤的功效。Livecyte的T细胞杀伤实验可以提供更多的细节来确定效应T细胞和靶细胞之间的相互作用动力学，可以从单个细胞着手，自动监测和量化效应细胞与靶细胞的总的接触时间，靶细胞凋亡前的最后一次接触时间、靶细胞上有几颗效应细胞、效应细胞与靶细胞的命运等数据。

0hr和24hr的叠层衍射定量相位成像（QPI）和荧光成像示例如下图，T细胞无标记，活的靶细胞为红色荧光标记，凋亡靶细胞为绿色荧光标记，第三列数据说明T细胞杀伤靶细胞的程度最明显：

Dashboard软件得到的靶细胞接触的T细胞的数目、累积T细胞接触时长和平均T细胞接触时长如下图：

T-细胞杀伤视频：